無(wú)縫克隆是一種新型基因克隆技術(shù)，它可以同時(shí)將1到多個(gè)片段高效的插入到任何載體。目前應用較廣泛的無(wú)縫克隆方法是Gibson Assembly和In-Fusion Cloning。這兩種方法的在原理上非常相似：都是通過(guò)外切酶產(chǎn)生黏性末端、然后利用體內或體外重組酶進(jìn)行連接，得到重組片段；但兩者用到的酶卻完全不同。我們一起來(lái)了解無(wú)縫克隆的秘密。

Gibson Assembly原理

Gibson Assembly是由Daniel Gibson和J.Craig Venter在2009年提出的。Gibson Assembly要求目的片段與線(xiàn)性化載體首尾具有一段互補重疊的同源臂序列；利用T5 exonuclease的5’一3’外切酶活性產(chǎn)生3’黏性末端，之后同源臂進(jìn)行互補配對，再利用DNA polymerase延伸補齊片段上的缺口部分，最后通過(guò)Taq DNA Ligase連接DNA片段中的缺刻，完成克隆組裝。

Gibson Assembly原理示意圖

In-Fusion Cloning原理

In-Fusion Cloning利用了In-Fusion酶能夠識別3’末端堿基，具有3’→5’外切酶活性的特點(diǎn)。通過(guò)In-Fusion酶產(chǎn)生5’黏性末端，互補重疊片段退火配對；再將重組片段轉化到感受態(tài)細胞內，重組片段序列中的缺刻在菌體內進(jìn)行連接，獲得重組序列。

In-Fusion Cloning原理示意圖

無(wú)縫克隆的優(yōu)勢

傳統的分子克隆技術(shù)依賴(lài)于Ⅱ型限制性?xún)惹忻负蚑4 DNA連接酶的使用，DNA片段與載體經(jīng)相同的限制性?xún)惹忻盖懈町a(chǎn)生相同的末端，然后利用T4 DNA連接酶反應實(shí)現片段融合。這種方法受到酶切位點(diǎn)限制，需選擇片段與載體序列內部沒(méi)有、而僅在載體多克隆位點(diǎn)存在的酶切位點(diǎn)。酶切連接的方法一次只能連接單個(gè)片段，無(wú)法實(shí)現多片段同時(shí)連接。且該方法中T4 DNA連接酶的輔助因子ATP易失活，影響克隆效率。無(wú)縫克隆與傳統的酶切連接相比，具有以下優(yōu)勢：

• 不受酶切位點(diǎn)限制

• 適用于任意載體、任意片段

• 一步連接1或多個(gè)片段，連接多片段耗時(shí)短

• 插入目的片段兩端不會(huì )添加額外序列（如保護堿基）

無(wú)縫克隆實(shí)驗關(guān)鍵影響因素

自無(wú)縫克隆技術(shù)被大家認識后，得到了眾多老師的青睞，但同時(shí)也有部分質(zhì)疑：連接效率為何總是不盡如人意？我們來(lái)細數影響無(wú)縫克隆實(shí)驗的關(guān)鍵因素有哪些？

無(wú)縫克隆實(shí)驗流程

片段質(zhì)量

• 確保DNA片段無(wú)核酸酶及其它酶污染、無(wú)乙醇等殘留；

• 純度正常：A260/A280值在1.6-1.9、A260/230值在2左右、紫外吸收峰圖正常；

• 濃度正常：插入片段與線(xiàn)性化載體濃度高于50 ng/μl，會(huì )使重組效率提高；

• 若模板濃度低、純度低，則連接效率降低。

載體線(xiàn)性化方法

線(xiàn)性化載體可以選擇反向PCR或酶切的方法：

• 可根據在載體插入位置是否有合適的酶切位點(diǎn)選擇具體方法。因Gibson Assembly反應體系內無(wú)雙鏈DNA連接酶，不會(huì )發(fā)生載體自連，線(xiàn)性化載體不需要進(jìn)行末端去磷酸化處理。酶切制備線(xiàn)性化載體建議使用雙酶切，且酶切后采用膠回收的方法回收產(chǎn)物，這樣利于降低假陽(yáng)性。

• 若沒(méi)有合適酶切位點(diǎn)或者多次酶切制備線(xiàn)性化載體均不成功，可以選擇反向PCR擴增，但不適合較大質(zhì)粒，如超過(guò)8 kb。

引物設計

• 目的片段引物設計：目的片段引物是由目的片段兩端序列加同源臂序列組成，同源臂長(cháng)度設置在16-45 bp，Tm值在58–65°C。同源臂越長(cháng)，有利于重組置換，但可能會(huì )影響目的片段擴增；

• 載體引物設計：確定目的片段插入位置，推薦借助Snapgene軟件設計反向PCR引物。

PCR擴增

• 反向PCR制備線(xiàn)性化載體及擴增目的片段時(shí)需要使用高保真酶；

• 制備線(xiàn)性化載體后使用Dpn I內切酶消化環(huán)狀質(zhì)粒模板，降低假陽(yáng)性克隆。

插入片段與線(xiàn)性化載體摩爾比

• 10 µl 反應體系，載體與插入片段總加入量建議在 0.01-0.3 pmol。插入片段與線(xiàn)性化載體的最佳摩爾比為 1:1-4:1；片段與片段的摩爾比為1:1。

• 推薦使用GenStar 克隆連接反應體系計算工具，快速計算載體與目的片段使用量。

感受態(tài)轉化效率

• 插入片段與載體全長(cháng)超過(guò)10 kb，屬于長(cháng)片段克隆，應使用高效感受態(tài)；如：轉化效率大于108 cfu/μg DNA的感受態(tài)細胞。

• 感受態(tài)細胞與重組質(zhì)粒用量比例不小于10:1。

   

只要注意以上幾點(diǎn)，高效無(wú)縫克隆實(shí)驗輕松get。

什么？不清楚無(wú)縫克隆實(shí)驗具體怎樣操作？

點(diǎn)擊下方鏈接，查看GenStar完整版無(wú)縫克隆實(shí)驗操作視頻，帶你迅速掌握無(wú)縫克隆技術(shù)！

http://www.cullmantrucks.com/videos_cont_154.html#coming