這個(gè)問(wèn)題出自XXX領(lǐng)導之口

那小編我著(zhù)實(shí)需要好好捋捋

為此小編我整日抓耳撓腮

百思不得其解

按理來(lái)說(shuō)，RNA的質(zhì)量沒(méi)問(wèn)題（28s和18s rRNA是否清晰、明顯，亮度比符合2:1），那么RT產(chǎn)生的cDNA一般是不會(huì )出現問(wèn)題的。但是偏偏有那么些個(gè)博學(xué)多才、才高八斗的抖機靈們想要一探究竟！

作為2G沖浪選手，小編我也機靈了一回

聽(tīng)聽(tīng)學(xué)霸網(wǎng)友們的聲音

一號學(xué)霸：

一般可以用電泳檢測是否合成適當大小片段的帶，這方法看cDNA大小沒(méi)問(wèn)題（自信）；如果想看堿基那當然還是測序或者使用探針檢測，就是比較麻煩（一如既往的自信）。

cDNA的質(zhì)量不好判斷，因為cDNA產(chǎn)物是smear，所以只能根據smear的分布范圍大概估計cDNA的質(zhì)量，分布范圍越大越好。但是，電泳看到的smear因為還和加樣量相關(guān)，所以即使沒(méi)有看到分布很廣的cDNA一鏈，也并不等于它不存在（淡定如斯）。

三號學(xué)霸：

用PCR檢測合成的cDNA中管家基因的量，如果出現比較好條帶，基本可以證實(shí)你的cDNA沒(méi)有問(wèn)題，我們實(shí)驗室一直這樣控制（眾人）。

如果不怕煩的話(huà)，可以在反轉第一鏈時(shí)加入少量同位素標記的dNTP，然后看一下放射比活度或做個(gè)放射自顯影（別出心裁）。

五號學(xué)霸：

首先看你用什么方法合成cDNA，如果隨機引物合成，三號的建議可以考慮（因為管家基因片段多數較短）。如果是LD PCR，則這些內參可能無(wú)法檢驗結果的好壞（有條有理）。

ds?cDNA檢測我倒是做過(guò)（LD PCR），理論上由總RNA起始的，哺乳動(dòng)物應該1.2%濃度的瓊脂糖凝膠于0.5~6kb（可達10kb以上）有明顯的smear，且有一些明顯的亮帶（腦、脾、胸腺除外）（過(guò)來(lái)人代表）。

七號學(xué)霸

做內參照??！如GAPDH,β-actin,β-MG等（言簡(jiǎn)意賅）。

.........（好多學(xué)霸，真好?。?/span>

這么多學(xué)霸出謀劃策，你，懂了嗎？

為了防止有人和小編一樣可愛(ài)，英語(yǔ)、術(shù)語(yǔ)分不開(kāi)，我先來(lái)解釋一下：

Smear：彌散帶

LD PCR：全稱(chēng)Long Ditance PCR即長(cháng)片段PCR

ds?cDNA：指依靠DNA聚合酶，與cDNA相互補的第二鏈cDNA

選擇試劑盒：您做RT實(shí)驗想得到什么樣的產(chǎn)物呢？

不含RNase H（合成長(cháng)度更長(cháng)）

預混組分（簡(jiǎn)單高效快捷）

一步法（輕松得到雙鏈cDNA）

? ? ? ?取約5ul反應產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，紫外成像檢測，呈現出大小在200-10Kb的拖帶，其中重心區域小1-4Kb之間，這說(shuō)明反轉錄完全，得到了高質(zhì)量的cDNA（如果RNA豐度低，電泳也可能是無(wú)產(chǎn)物，但是這種情況不代表PCR會(huì )無(wú)結果）。

cDNA測序（受限較多，但結果精準）

? ? ? ?全長(cháng)雙鏈cDNA做分子克隆實(shí)驗，然后通過(guò)測序結果精確判斷。

a.? Oligo(dT)18和Random Primers按比列使用可解決poly(A) mRNA模板限制和長(cháng)度限制的問(wèn)題

b.? 序列特異性引物可獲得你想要得目的序列

探針檢測（相對較麻煩，但結果較精準）

? ? ? ?qPCR或RT-qPCR步驟

管家基因/內參基因（引物類(lèi)型限制，適用范圍受限）

? ? ? ?以反轉錄產(chǎn)物為模板，擴增內參基因，擴增有結果，說(shuō)明cDNA的質(zhì)量基本可以保證，這個(gè)方法限制于隨機引物擴增（因為管家基因片段多數較短）。

? ? ? ?而Oligo(dT)18與序列特異性引物擴增或我們做LD PCR（2kb、10kb等長(cháng)片段）時(shí)，這些內參擴增的幾率遠大于全長(cháng)或大片段cDNA的擴增，這時(shí)可能就無(wú)法通過(guò)內參來(lái)檢驗cDNA擴增結果的好壞。

同位素標記

? ? ? ?反轉錄中加入少部分同位素標記的dNTP

? ? ? ?放射比活度或放射自顯影檢測