說(shuō)起反轉錄，小編相信當大家提取出高質(zhì)量的RNA時(shí)，肯定開(kāi)心的手舞足蹈，滿(mǎn)心歡喜想著(zhù)接下來(lái)的實(shí)驗輕輕松松搞定！這樣想沒(méi)錯，但是如果你想在論文或者匯報中得到漂亮的數據，那反轉錄這一步也非常關(guān)鍵。所以今天小編給大家梳理了反轉錄實(shí)驗過(guò)程中需要注意的幾個(gè)要點(diǎn)，希望大家在實(shí)驗過(guò)程中多多留意，獲得漂亮的數據。
一、選擇最佳的反轉錄引物
反轉錄引物一般分為三類(lèi)：oligo dT、隨機引物、基因特異性引物。oligo dT，可識別具有poly(A)尾的真核mRNA，從而獲得真核生物mRNA全長(cháng)。隨機引物，可以結合到樣本中的任何類(lèi)型RNA，但并不能獲得整個(gè)基因全長(cháng)的cDNA。基因特異性引物，是根據實(shí)驗者的特定需求設計出來(lái)的，適用于目的序列已知的情況，產(chǎn)生所需的cDNA。
二、考慮RNA的二級結構
若要獲取全長(cháng)RNA的反轉錄，那么我們就需要考慮RNA內部是否含有二級結構，因為反轉錄酶在遇到二級結構時(shí)會(huì )終止反應或從模板上脫落下來(lái)。通常GC含量高的基因意味著(zhù)RNA很難被變性且不可能是單鏈。高效且熱穩定性強的反轉錄酶，可有效克服高GC、低豐度模板的反轉錄難題。
三、去除基因組DNA
污染性基因組DNA(gDNA)可能會(huì )干擾RNA反轉錄，并導致后續PCR或qPCR實(shí)驗結果出現假陽(yáng)性、高背景或檢測率低等情況。通常在RNA提取過(guò)程中加入合適濃度的DNase I，37℃加熱10-15min，去除干擾基因組DNA。另外，如果是做qPCR實(shí)驗，更簡(jiǎn)單的方法則是選用含有去除基因組DNA的試劑盒。
四、選擇合適的反轉錄方法
RT-PCR和RT-qPCR有兩種選擇：一步法和兩步法。一步法，反轉錄和（q）PCR擴增是在同一個(gè)反應管中進(jìn)行。兩步法，反轉錄與（q）PCR擴增反應單獨進(jìn)行。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。
注意事項這么多，您需要一套可全面應對上述問(wèn)題的高性能產(chǎn)品！
GenStar新一代StarScript III M-MLv反轉錄酶，擁有卓越的cDNA合成能力，全面提升合成產(chǎn)量、提高熱穩定性，克服了低豐度、復雜模板難題！
產(chǎn)品特點(diǎn)
·熱穩定性
可耐受37-65℃反應溫度，適合高GC復雜模板的反轉錄反應。
·兼容性強
適用于不同物種、各種類(lèi)型的RNA模板。
·靈敏度高
針對各種RNA模板，克服低豐度、復雜模板難題。
·產(chǎn)品全面
根據不同的實(shí)驗應用場(chǎng)景，可選擇含去基因組試劑、預混試劑或試劑盒。
·應用廣泛
可應用于基因全長(cháng)cDNA合成、qPCR等實(shí)驗。
產(chǎn)品性能展示
1. StarScript III耐受37-65℃反應溫度
不同的反轉錄反應溫度獲得的水稻cDNA，1 kb片段擴增
StarScript II最佳反應溫度為42℃，耐受50℃；StarScript III最佳反應溫度50-55℃，耐受65℃。
2. 低豐度、復雜模板也能完美反轉錄
以水稻RNA為模板，不同品牌反轉錄反應后，qPCR檢測結果
GenStar StarScript III靈敏度高，對于高GC、低表達基因的檢測效果理想。
3. 線(xiàn)性范圍廣，反轉錄效果佳
GenStar StarScript III一步法qRT-PCR試劑盒-探針?lè )ǎ║NG）（Cat#A338）檢測小鼠RNA模板，檢測基因GAPDH
結果顯示，A338靈敏度高，檢測下限可達1 pg；熒光信號采集能力強，兼顧高擴增效率；具防污染體系，有效避免氣溶膠污染。
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·反轉錄預混試劑：反轉錄反應無(wú)需調整，操作簡(jiǎn)便。
·去基因組反轉錄預混試劑：去gDNA，定量結果準確可靠。
·一管化去基因組反轉錄預混液：一管化、含去gDNA，qPCR模板制備的最佳選擇。
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一步法RT-PCR專(zhuān)用預混液，反轉錄和PCR在同一管內進(jìn)行，操作便攜。
一步法qRT-PCR
高特異，高靈敏，速度快，可選防污染體系，適用于RNA病毒檢測的qRT-PCR預混液。
