癌癥的發(fā)病機制較為復雜，目前學(xué)界廣泛接受的觀(guān)點(diǎn)是相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉變的根本原因。即在各種因素的影響下：
原癌基因產(chǎn)生突變，導致細胞無(wú)限制生長(cháng)；
抑癌基因失活，導致細胞增殖與休眠紊亂，不能正常凋亡。
最終質(zhì)變?yōu)榧毎敖M織水平的變異，導致癌癥的發(fā)生。
所以癌癥的發(fā)生和發(fā)展實(shí)際上是一個(gè)較為漫長(cháng)的過(guò)程，在臨床中，完全可以通過(guò)基因檢測，達到早發(fā)現、早診斷、早治療的目的。
目前，癌癥相關(guān)基因檢測主要基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和高通量測序（NGS）兩項技術(shù)，其中qPCR具有多項技術(shù)優(yōu)勢：準確率高、特異性強、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、成本較低，被廣泛應用于實(shí)驗室及臨床診斷中。
今天，我們就來(lái)好好聊一聊qPCR
探針?lè )╭PCR 技術(shù)原理：
qPCR依據檢測原理不同，分為染料法和探針?lè )?。探針?lè )╭PCR需針對目的基因設計特異性引物與特異性熒光探針，探針的5’端標記一個(gè)熒光報告基團（Reporter，如FAM、VIC、HEX等），3’端標記一個(gè)熒光淬滅基團（Quencher，如TAMRA、BHQ1等）。
當熒光探針保持結構完整時(shí)，探針與模板退火結合，其特異性結合位點(diǎn)位于正反兩條引物之間。5’端報告基團受儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3’端淬滅基團淬滅，儀器檢測不到5′端報告基團所激發(fā)的熒光信號。
隨著(zhù)擴增進(jìn)行，DNA聚合酶在延伸過(guò)程中遇到與模板結合的探針，因其雙鏈特異性的5’-3’外切酶活性，就會(huì )切割熒光探針，釋放5’端報告基團游離于反應體系中，遠離3’端淬滅基團，此時(shí)5’端報告基團受激發(fā)所產(chǎn)生的熒光信號就可以被儀器檢測到。每擴增一條DNA鏈，就有一個(gè)游離的熒光分子形成，熒光信號的強弱與擴增產(chǎn)物量成正比，最終通過(guò)數據分析實(shí)現對初始模板的定量。
圖1. 探針?lè )╭PCR技術(shù)原理示意圖
作為一種有效的癌癥篩查檢測及伴隨診斷技術(shù)，探針?lè )╭PCR涉及領(lǐng)域涵蓋癌癥的預防與治療。這項技術(shù)不但能有效地檢測到基因的突變，還可以準確檢測相關(guān)基因的表達量。
qPCR應用于癌癥篩查
探針?lè )╭PCR目前已廣泛應用于多種癌癥相關(guān)基因的表達檢測，包括：
端粒酶hTERT基因
慢性粒細胞性白血病WT1基因
腫瘤ER基因
前列腺癌PSM基因
宮頸癌相關(guān)病毒HPV
……
其中女性高發(fā)惡性腫瘤之一的宮頸癌，早期發(fā)現并及時(shí)治療，可以達到非常好的療效，治愈率在90%左右。目前已證實(shí)高危人乳頭瘤（HPV）病毒持續感染與宮頸癌有著(zhù)密切聯(lián)系，因此，對于高危HPV病毒的專(zhuān)項檢測，已成為宮頸癌篩查的重要手段。高危HPV病毒核酸檢測與細胞學(xué)聯(lián)合篩查被越來(lái)越多的應用于臨床。
圖2. 高危HPV病毒核酸檢測與細胞學(xué)聯(lián)合篩查可有效降低漏診率
qPCR應用于抗癌藥物研發(fā)
除此之外，探針?lè )╭PCR還可應用于抗癌藥物的研發(fā)。在新藥的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，快速了解藥物對癌癥進(jìn)程的影響可以為新藥開(kāi)發(fā)節約大量的人力、時(shí)間和資金。
與Elisa等方法相比，探針?lè )╭PCR技術(shù)可以快速、準確、靈敏地測定血液或組織中目的基因的表達量，為比較不同配方的療效、用藥量、用藥時(shí)間等，提供快速、準確的評價(jià)。
圖3. qPCR檢測流程示意圖
手把手實(shí)驗教學(xué)
p53是重要的抑癌基因，幾乎參與所有癌癥的發(fā)生與發(fā)展，其編碼蛋白有促使損傷DNA修復、損傷細胞凋亡從而防止癌變的功能。
假設現在有兩種配方藥物，分別加入細胞培養液中，看不同配方藥物對p53 mRNA水平的影響，應該怎樣來(lái)設計實(shí)驗以及分析結果呢？
實(shí)驗設計:
分別種三皿細胞，一皿加入配方一藥物，另外一皿加入配方二藥物，剩下一皿加入對照。處理一段時(shí)間之后，分別收集細胞并提取RNA，再進(jìn)行反轉錄，以反轉錄得到的cDNA為模板進(jìn)行qPCR。qPCR如下圖所示進(jìn)行加樣：
圖4. qPCR加樣示意圖
注意區分 “技術(shù)重復”和“生物學(xué)重復”這兩個(gè)概念，圖4中p53和β-actin每個(gè)實(shí)驗組和對照組都各有三個(gè)qPCR復孔，這是技術(shù)重復，目的是消除本次實(shí)驗的操作誤差。生物學(xué)重復指的是做三次獨立的重復試驗，目的是消除組內誤差、提高結果的可靠性。在本例中，就要求在其他時(shí)間另外再種三皿細胞，再分別處理后提取RNA，接著(zhù)再做反轉錄和qPCR，如此做了三次獨立重復實(shí)驗之后才能算作三次生物學(xué)重復，統計誤差的來(lái)源應該包括生物學(xué)重復和技術(shù)重復。
做完上述實(shí)驗之后，假設得到結果如下：
表1. Test1 Ct值結果
再做兩次獨立重復實(shí)驗，假設得到結果如下：
表2. Test2 Ct值結果
表3. Test3 Ct值結果
結果分析:
下表為完整計算過(guò)程（ΔCt=Ct p53-Ct β-actin；ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗組-ΔCt對照組）：
表4. 相對表達量計算方法示例
整理一下數據（相對表達量平均值=2-ΔΔCt平均值）：
表5. p53相對表達量數據
就可以生成p53 mRNA水平的相對表達量柱形圖了：
圖5. p53 mRNA水平相對表達量柱形圖
到這里，離獲得實(shí)驗結論只有一步之遙。還需要確定實(shí)驗組與對照組之間是否存在顯著(zhù)性差異。
首先需要確定的是，用什么方法來(lái)進(jìn)行檢驗？
因為各實(shí)驗組與對照組之間毫無(wú)相關(guān)存在，所以應該采用獨立樣本t檢驗的方法?？梢允褂肧PSS統計軟件來(lái)統計P值，也可以直接使用Excel軟件來(lái)進(jìn)行t檢驗。
P<0.05代表存在顯著(zhù)性差異
P<0.01代表存在極顯著(zhù)差異
在本例中，配方一實(shí)驗組P值<0.01，配方二實(shí)驗組P值
配方一藥物處理極顯著(zhù)提高了p35 mRNA水平的表達。
配方二藥物處理顯著(zhù)提高了p35 mRNA水平的表達。
總結:
需要強調的是，本文例舉的方法只適用于單因素處理的比較，該因素（本例中為加藥）處理得到的結果應當是穩定的。在本例中，即表示在相同細胞中加相同濃度的相同配方藥物，p53 mRNA的變化水平應當是一致的。
探針?lè )╭PCR能夠快捷地提供更加客觀(guān)、精確的基因定量檢測結果，對高發(fā)癌癥的普查和診斷、相關(guān)藥物的研發(fā)具有重要意義。
但這項技術(shù)也存在假陽(yáng)性導致過(guò)度診斷的問(wèn)題，可采用探針?lè )╭PCR同時(shí)檢測多個(gè)相關(guān)基因，或與其他一些技術(shù)如細胞學(xué)檢測等結合應用，進(jìn)行綜合性指標分析。
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重點(diǎn)產(chǎn)品推薦
2×RealStar Fast探針?lè )╭PCR預混液（Cat#A351）
易檢：靈敏度更高，適合低拷貝基因，易檢出。
更快：預混型一管化設計，使用方便；可進(jìn)行多重檢測，一次檢出多個(gè)基因。
更穩：重復性好，產(chǎn)品性能穩定。
更準：采用抗體型修飾熱啟動(dòng)酶，特異性好，結果更準確。
更低：性?xún)r(jià)比高，實(shí)驗成本更低。
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